A proud legacy of success with
a strong global focus

試験とサービス

無菌試験

PDF - Meeting USP/EP/CFR sterility testing requirements with a two media assay

無菌試験には、直接接種法、メンブレンフィルター法、直接転移法という主に3つの方法があります。

無菌試験では主に3つの方法が用いられます。

1. 直接（接種）法

直接法では、適切な培地を含有するチューブまたはボトルに検体を直接接種し、一定時間インキュベートします。直接法の利点は以下のとおりです。

• 容易にろ過することのできない原材料の無菌試験ができます
• 細菌・真菌（B＆F）否定試験に使う検体量が少なくて済みます

    2. メンブレンフィルター法

メンブレンフィルター法では、メンブレンフィルターに検体を通します。このメンブレンフィルターは、不純物としての微生物を保持しながら検体の液体部分（阻害物質を含む）を通過させて試験系から除去できるようにデザインされています。その後このメンブレンは適当な滅菌洗浄液で洗浄されます。次にフィルターユニットに適当な滅菌洗浄液を添加し、通常直接接種法と同じ時間インキュベートします。メンブレンフィルター法の利点は以下のとおりです。

• 大量のサンプルを処理可能（最高500 mL）
• 適切な洗浄剤によりメンブレンフィルターを洗浄することにより、微生物の増殖を抑制する阻害物質を除去できる

    3. 直接転移法

弊社は、直接転移法（direct transfer）のカスタムメードプロトコールをご提供いたします。一般に、直接転移法は、固体剤形、医療機器、軟膏、クリーム剤に用いられます。無菌ではない製造工程により製造された検体については、バイオバーデン（微生物限度）試験を実施する必要があります。原材料の用途に応じて、滅菌していない検体を望ましくない生物の有無について評価する必要がしばしば生じます。望ましくない生物の評価については、微生物限度試験が推奨されます。

マイコプラズマ試験

マイコプラズマは、細胞培養において最も頻度が高い汚染物質の1つです。

マイコプラズマは、極めて少量でも、正常な細胞プロセス、ウイルス産生率、リンパ球増殖を変化させる可能性があります。このため、細胞基材製造においては、マイコプラズマ試験が不可欠です。また、マイコプラズマは直接的または間接的にヒト疾患に関与するため、規制上のさらに大きな懸念事項となっています。一般的なマイコプラズマ試験は、寒天培地で培養可能なマイコプラズマおよび寒天培地で培養できない（細胞依存性／細胞内）マイコプラズマの有無について検査する方法を用いることにより行ないます。寒天で培養可能なマイコプラズマ種の検出には、寒天培地および半固体培地を用います。寒天培地で培養できないマイコプラズマについては、指標細胞株を用いて検出します。弊社は、米国FDA、PTC、CFR、EPおよび日本の規制に従って、多様なマイコプラズマ試験を実施しております。EPについては、静マイコプラズマ作用試験を必要とします。PCRによるマイコプラズマ検出も実施可能です。

バイオリライアンス社のHyMy™（ハイブリッドマイコプラズマ）試験では、性能を実証済みのQ-PCR（Q-PCR）技術を用いて標準法を強化し、試験プロセスの感受性、特異性、スピードを改善しています。HyMy試験では、Q-PCRエンドポイントに生物学的増幅を組み合わせることにより、少量のマイコプラズマ汚染が検出できるだけでなく、生存可能なマイコプラズマを優先的に検出することも可能になっています。HyMy試験はcGMPに則って実施され、現行のICHガイドラインによりバリデーションされています。PCRのエンドポイントにより従来の培養試験法の半分の時間でサンプルを評価することが可能です。HyMyの完全なGMP監査報告書を17日前後で作成できます。

 

エンドトキシン検出試験

• バイオリライアンス社のLAL試験では、アメーバ様溶解物を用いた凝集反応を利用して、エンドトキシンLPSを特異的に検出します。エンドトキシンLPSは、グラム陰性細菌の細胞外膜に局在するコンポーネントです。
•米国薬局方（USP）では、エンドトキシン検出に用いられるLAL法が2種類記載されています。そのうちの1つであるゲル化法は、LAL試薬がエンドトキシンにより凝集する作用を利用してエンドトキシンを定量します。凝集反応の酵素カスケードの構成要素であるセリンプロテアーゼにより、水溶性コアグロゲンが分解されて非水溶性タンパク質であるコアグリンが生成し、凝塊が形成されます。
• USPに掲載される2つ目の方法は光学的手法です。
• この比色法では、セリンプロテアーゼが比色基質として作用し、発色団が生成されます。この発色団の量を吸光度測定法により測定します。弊社では、ゲル化法および比色法のいずれかを用いた試験を行ないます。試験の感度は、各試験法のプロトコールを基礎にしています。

 

バイオバーデン（微生物限度）試験

• バイオバーデン試験の目的は、好気的条件下で増殖する可能性のある常温菌および真菌を定量的に計数すること、検出される可能性がある特定の微生物が存在しない、または発生数が少ないことを評価することです。
• 試験は、現行のUSP＜61＞および＜62＞、「Microbial Enumeration Tests」および「 Tests for Specified Microorganisms」の基準と同等以上の水準で行われています。

 

マイコバクテリウム試験

マイコバクテリウム属試験の目的は、直接接種法を用いて、バイオバーデンをほとんど含有しない検体にマイコバクテリウム属種が存在するかどうかを検出することです。

 

In vitroウイルス試験

生物学的製剤の製造に用いられる細胞株、ウイルスシード、原材料は、ウイルスなどの外来性物質を含有している可能性があります。外来性ウイルスのin vitro試験の目的は、マスターセルバンクおよびワーキングセルバンク、マスターウイルスシードおよびワーキングウイルスシード、未精製バルクハーベストおよびEPC（大量培養した後の細胞）におけるウイルスを検出することにあります。原材料や添加物および細胞溶解液における多数の種特異的ウイルスの有無を検出するin vitro試験も利用できます。

 

In viｖoウイルス試験

弊社は、外来性ウイルスおよび種特異的ウイルスの有無を検出するin vivo試験を実施しております。

細胞培養系において細胞変性など認知可能な影響を及ぼさないウイルスは、動物実験系で検出することができます。日米EU医薬品規制調和国際会議（ICH）の「Viral Safety of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin」（Q5A）文書、米国食品医薬品局および生物学的医薬品評価・研究センター（FDA／CBER）の1993年の細胞株特性解析に関するPTC文書、医薬品適正委員会（CPMP）発行のNotes for Guidanceでは、外来性ウイルスの有無を検査するin vivo試験を医薬品製造のさまざまな段階で実施することが要求されています。

ウイルス特異的試験

バイオリライアンス社は、セルバンク、ウイルスシードストック、原材料、最終製品における種特異的ウイルスや外来ウイルスを検出するようデザインされたQ-PCR試験を実施しています。各試験法は、ICH Q2（R1）ガイドラインおよびEP 2.6.21に従って完全にバリデーションされています。ヒトウイルス、呼吸器系ウイルス、ブタウイルス、サルウイルス、イヌ、ネズミ、およびその他多数の特異的標的PCRについて試験を実施いたします。顕現性ウイルスについては、試験法開発およびバリデーションサービスも行なっています。

 

電子顕微鏡試験

バイオリライアンスは、電子顕微鏡解析を幅広く行なっています。透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、生体液中または細胞基材の外来性物質の有無を検出します。TEM法により培養細胞の形態の特性解析が可能になるため、その形態をもとに、細胞培養物中のウイルス粒子を可視化および識別することができます。生体液を検査することによりウイルス粒子を定量し、サンプルのウイルス量を推定します。ウイルス量は、ウイルス性汚染物質の不活化または除去を行なう純化工程の性能をバリデーションする前に測定する必要があります。TEM法で確認されたウイルス粒子の形態は、ウイルスを区別する主な基準のひとつです。ウイルス粒子の定量は、薄切片TEMまたはネガティブ染色TEMにより実施することが可能です。

 

残留汚染試験

残留DNA量の測定に用います。汚染DNA量は定量法により測定する必要があります。弊社では、広範な宿主種、CHO細胞、マウス細胞、ヒト細胞、大腸菌、酵母、イヌ細胞、ピチア属、ベロ細胞についてQ-PCR技術を用いて残留DNA量を評価しています。この方法によりDNA量をフェムトグラム単位で検出することが可能であり、FDAおよびWHO勧告に従った試験となります。また、宿主細胞の残留タンパク質の定量も承ります。

 

ウサギ発熱物質試験

エンドトキシンおよびその他の発熱性物質の検出には、ウサギにおける発熱性物質試験が用いられます。LAL試験によるエンドトキシン検出が不可能であったり、適切でなかったりする場合に適用されます。このような事例としては、検体による干渉、エンドトキシン中和能のある化合物の存在、エンドトキシン以外の発熱性物質の存在、ある種の規制要件などがあげられます。この場合、検体における発熱性物質の存在は、ウサギによる発熱性物質試験を実施して判定します。バイオリライアンス社では、21CFR、USP、EPの要件を満たす試験法を提供しています。

一般的安全性試験

一般的安全性試験は、実験動物を用いて実施される7日間の試験であり、その目的は、生物学的製剤中に存在する外来の毒性汚染物質を検出することです。試験は、21 CFRおよびEPの要件に従って行なわれます。